【CEM MultiPep】SPOT 合成的質(zhì)量控制

SPOT 方法由 Ronald Frank 開(kāi)發(fā)，用于在均質(zhì)膜載體上的不同位點(diǎn)同時(shí)合成多肽。該技術(shù)的原理是將預活化的氨基酸衍生物的小液滴分配到多孔膜上預定義的位置陣列上。液滴被吸收并形成單獨的反應室，用于固相合成中的化學(xué)反應。大量不同的點(diǎn)可以排列在一張膜上，并且這些點(diǎn)中的每一個(gè)都可以通過(guò)相應試劑溶液的手動(dòng)或自動(dòng)輸送來(lái)單獨處理。每個(gè)區域的點(diǎn)數和點(diǎn)大小由膜的吸收能力和液滴的體積決定。根據基質(zhì)的特定功能，點(diǎn)大小與合成的特定規模相關(guān)。 Ronald Frank 最初使用的濾膜仍然是蕞受歡迎的載體，由改性纖維素濾紙制成。

在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽陣列是一種創(chuàng )建大量肽的廉價(jià)且方便的方法。它們通過(guò)活化氨基酸液滴的沉積在纖維素膜支持物上合成。與之前相比，膜和氨基功能之間的鍵合在穩定性上得到了改善。它現在對 100% 三氟乙酉夋穩定，并且在堿性條件下進(jìn)行試驗不會(huì )導致肽損失。該鍵不能被切割以釋放肽。肽保持共價(jià)連接，因此難以進(jìn)行質(zhì)量控制。有幾種方法可以獲取有關(guān)合成質(zhì)量的信息。

通常在每個(gè)合成周期中都有一個(gè)乙?；襟E，該步驟應封頂所有未反應的鏈。如果出現嚴重的合成問(wèn)題，在后面的合成步驟中就會(huì )出現完荃的封頂，而不會(huì )留下任何游離的氨基。因此，N端的報告分子將表明大部分合成是正常的。有用的報告分子有

• 生物素，用簡(jiǎn)單的普通鏈霉親和素-報告基因共軛物檢測

• 鏈霉親和素報告共軛物也能檢測到 N 端的鏈霉標簽II(NWSHPQFEK)。

• 羅丹明染料，像氨基酸一樣容易耦合，在日光條件下可見(jiàn)

上圖為煙草在 LUYOR-3410 紫外線(xiàn)燈照射下觀(guān)察到的效果

在 MultiPep 1&2 合成器上合成肽陣列是一種廉價(jià)而方便的大量合成肽的方法。它們是通過(guò)沉積活化氨基酸液滴在纖維素膜支架上合成的。與第一份出版物相比，膜與第一個(gè)耦合氨基酸功能之間的結合穩定性有所提高?，F在，它對 100% 的反式脂肪酸都很穩定，在堿性條件下進(jìn)行檢測也不會(huì )導致肽的損失。這種鍵不能被裂解以釋放肽，而是保持共價(jià)連接，因此很難進(jìn)行質(zhì)量控制。如果在第一個(gè)循環(huán)中引入了可裂解連接體（如 Rink 酰胺連接體），則整個(gè)肽都可以用反式

脂肪酸釋放出來(lái)。在這種情況下，必須在側鏈脫保護之前切出該點(diǎn)并單獨處理。

建議程序:

    1. 根據儀器手冊設置合成。

    2. 在合成的第一個(gè)循環(huán)中，將 FMOC-Rink 酰胺連接物引入所需的質(zhì)控肽。***質(zhì)控肽可在膜角附近合成，以便于去除。

    3. 合成后，從儀器上取下干燥的膜并觀(guān)察斑點(diǎn)

    4. 將切下的質(zhì)控點(diǎn)放入 1.5 mL 螺旋蓋微量離心管（或類(lèi)似試管）中，加入 150 uL 通用裂解混合物（或自選混合物）。蓋緊試管蓋，培養 2-4小時(shí)。這將使肽從各自的林克酰胺連接體上裂解，并去除側鏈保護基團。

    5. 將含有已裂解多肽的上清液轉移到一個(gè)新的微量離心管中，并丟棄裝有已用斑點(diǎn)的離心管。

    6. 使用標準實(shí)驗室程序將溶液完荃干燥（應注意強酸和實(shí)驗室設備）。

    7. 用 10 uL 0.1 % 的反式脂肪酸重溶干肽。

    8. 對該溶液進(jìn)行 MALDI分析，基質(zhì)一般為1μL 或更少。(注意 MW為 -1)

注：三氟乙酉夋(TFA)是一種揮發(fā)性很強的酸。整個(gè)裂解和加工過(guò)程必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行。在此階段必須佩戴安全眼鏡、手套和白大褂，并遵守所有安全規定。所有廢物必須按照國家規定進(jìn)行處理。

通用裂解混合物

• 92.5%(vv)三氟乙酉夋，TFA

• 5% (v/v) 三異丙基硅烷

• 2.5% (vv) 水

用于可裂解點(diǎn)的 Fmoc 鏈接器

Su et al.

Epigenetics&Chromatin volume 7, Article number:7(2014)，組合 PTM 組蛋白肽微陣列合成使用 RespepSL 自動(dòng)合成器(Intavis AG，KoIn，Germany,MultiPep 1CEM)在改性纖維素上合成肽。將Fmoc從 celluspot 中移除并耦合 Cy3(Lumiprobe,公司)后，就得到了纖維素-Cy3 染料共軛的斑點(diǎn)對照?？瞻准毎邔φ战M是通過(guò)去除色斑上的 Fmoc 并將試紙置于溶解條件下而制成的。對于肽，初始偶聯(lián)包括等摩爾量的Fmoc-Ala-OH 和 Boc-Ala-OH，以減少樹(shù)脂負載并提高合成質(zhì)量。每次合成的肽都含有可被酸裂解的鏈節，以便通過(guò)高效液相色譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行質(zhì)量評估(附加文件 12:表 S2)。此外還加入了 20 原子的聚乙烯連接體(PE)(Novabiochem 公司)，以提高合成效果和陣列中的蛋白質(zhì)結合力。Fmoc-Glu-(biotinyLPEG)-OH(Novabiochem)是鏈霉親和素的對照。

使用標準的 Fmoc/tBu 化學(xué)方法生成 13 氨基酸肽。如前文所述 [24]，肽的 PTM 以適當保護的單體形式引入。合成完成后，用 82.5% 的三氣乙酸(TFA)去除側鏈保護基團:5% 硫代苯甲醚5% 水:5%二氯甲烷中的飽和苯酚:2.5%乙烷二硫醇，持續 90 分鐘(每個(gè)點(diǎn)150μ)。取出溶液，換上 250 μ的 88.5% 反式脂肪酸、4% 三氟甲磺酸、2.5% 三異丙基硅烷和 5% 水，輕輕攪拌過(guò)夜以溶解纖維素。用冷的二乙酉迷沉淀肽纖維素共軛物兩次，晾干幾分鐘，然后重新溶解到100μ 的二甲基亞砜(DMSO)中。

Boisguerin et al.

Chemistry & Biology, Vol. 11, 449–459, April, 2004，我們用與 PSD-95 PDZ3-結構域結合的多肽 NYKQTSVCOOH 測試了硫醚環(huán)化的效率[148]。溴乙?；?10)(粗體數字 10-12 參考圖 3.5 (A))是在幾個(gè)可裂解點(diǎn)上合成的(通過(guò)加入Fmoc-Rink 連接器實(shí)現可裂解性)。3 小時(shí)后，用反式脂肪酸將肽產(chǎn)物 h-1、h-2 和 h-3 從點(diǎn)上裂解，并用 HPLC 和 ESI-MS 進(jìn)行分析(圖 3.5 (B))。對反應產(chǎn)物的分析清楚地表明，在 h-3 條件下，硫醚-環(huán)化反應的效率很高。為了確定肽序列對環(huán)化!清除步驟的影響，我們又合成了兩種膜結合溴乙?；?EFHAALGSYVCOOH和 QHIDSQKKACOOH。

關(guān)于點(diǎn)合成的常見(jiàn)問(wèn)題

1. SPOT 合成的時(shí)間是什么時(shí)候?

使用雙偶聯(lián)方案合成 4x384 肽時(shí)，每個(gè)周期需要 2 個(gè)小時(shí)，最后處理需要 2-3 個(gè)小時(shí)。每個(gè)周期的操作時(shí)間約為 30 分鐘，用于制備活性衍生物和清洗膜。

2. 膜上肽的密度是多少?

標準密度為 10x15 厘米纖維素膜片上 600 個(gè)肽網(wǎng)格，中心到中心的距離為 4.2 毫米。也可以自由定義其他網(wǎng)格。在非常受控的條件下，纖維素膜上的密度可達 25x40 個(gè)點(diǎn)。

3. 一個(gè)點(diǎn)有多少肽?

我們提供的膜經(jīng)過(guò)衍生處理后，游離氨基的負載量約為 300-400 nmol/cm2。每個(gè)斑點(diǎn)的負載量可通過(guò)面積計算得出。

例如:一個(gè)直徑為6毫米的點(diǎn)約有 80 納摩爾的肽，一個(gè)直徑為3 毫米的點(diǎn)約有 20 納摩爾的肽。

4. 在 CelluSpots 合成過(guò)程中，應選擇哪種品牌的濾紙放在框架下?

建議使用 Whatman 540 或 541

5. 乙?；?lài)氨酸如何用于合成?

獲取 Fmoc-LyS(Ac)-OH，CAS#159766-56-0，并按照與 MultiPep 1&2 相同的標準偶聯(lián)方法進(jìn)行偶聯(lián)。

6. Ahx連接劑的親水性對應物是什么?

建議使用 Fmoc-8-氨基-3,6-二氧雜辛酸。

7. 如何提高小規模濾板合成的產(chǎn)量?

使用 Ramage 樹(shù)脂(PC-01-0601)，用小容量裂解雞尾酒可立即裂解肽。

8. 如何使用 MultiPepRSi 或 RespepSL 合成 PNA 使用以下設置:

PNA 單體：0.3M 在 NMP 中使用新型偶聯(lián)劑

活化劑：HATU 或 PyAOP(0.6M 溶液);HATU 更穩定，PyAOP 應每天更新。

堿混合物：DIPEAV2,6-lutidine(1.2/1.8M，DMF 中)，兩種堿在 DMF 中的混合比例為20.09%(vvv)。

9. 如何減少消旋化?

在所有合成的肽中，外消旋化約占 1%。消旋化會(huì )使肽更加穩定，從而導致錯誤折疊。苯丙氨酸和組氨酸會(huì )發(fā)生消旋化。組氨酸在 50C 或更高的溫度下很容易發(fā)生消旋化。DIC 和 OxymaPure 的組合可減少消旋化。PyOxim 和 NMM 的組合更易發(fā)生消旋化，但不如 HBTU 和 NMM 的組合。

10. 如何減少脫保護過(guò)程中天冬氨酸的形成?

在整個(gè)合成過(guò)程中，用 20% 的哌啶在 DMF（含 0.1M HCOOH）中對 Fmoc 基團進(jìn)行脫保護，以避免天冬酰亞胺副反應。

11. 如何從 SPOT 膜上裂解多肽?

使用 Fmoc 鏈接劑作為第一個(gè)氨基酸。切出所需的點(diǎn)并涂上裂解液。Rink-Linker 會(huì )自行裂解并生成 C 端酰胺。

12. 我的 SPOT 肽中有一部分 N 端酰胺被乙?；?。如何避免這種情況?

最后一個(gè)氨基酸使用叔丁氧羰基氨基酸。這樣可以避免濾紙和濾紙下方通道中的微量醋酸酐造成乙?；?。

13. 溶解了 NMP 的氨基酸可以保存多久?

除半胱氨酸和蛋氨酸外，氨基酸溶液可在 4℃ 下保存一個(gè)月。請注意，如果粉未變質(zhì)，丙氨酸和谷氨酸會(huì )產(chǎn)生沉淀。